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技術專欄:關于流式細胞術(FCM)

點擊次數(shù):17   發(fā)布時間:2024/7/15 14:04:35

    FCM是利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分析技術。然而,在FCM的實際應用過程中,要想得到高質量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事,F(xiàn)就FCM實驗中的常見問題進行分析,希望能幫助相關實驗人員提高實驗成功率。


    一、怎么選擇合適的對照?


    1)同型對照:使用同型抗體做平行實驗,主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。


    2)陰性細胞對照:使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗,主要目的是消除抗體的非特異性結合。


    3)二抗對照:第二抗體多為熒光標記的多抗,非特異性結合一般較高,可能造成基礎熒光值偏高,設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。


    4)陽性對照:一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗,主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。


    5)空白對照:不進行任何標記的細胞,主要目的是用于測定基礎熒光信號表達值。


    二、收集的細胞通過流式儀檢測時,一般多少的細胞量合適?


    進行流式檢測時,至少需要記錄5000個活細胞,一般調整細胞密度至1*106/100ul進行流式檢測。


    三、FCM檢測過程中如何設門(gating)?


    一般根據(jù)散射光進行設門,即我們通常所說的前散(forward scatter, FSC)和側散(side scatter, SSC)來設門。FSC的大小與細胞的直徑成正相關,不同的細胞,細胞越大,其FSC越大;反之越小。SSC的大小與細胞內顆粒結構的質量成正相關,不同的細胞,細胞內顆粒結構越復雜,質量越大,其SSC越大;反之越小。


    四、FCM檢測過程中如何調節(jié)補償?


    在FCM檢測過程中,如果存在多色,則必須進行熒光補償調節(jié)。調節(jié)補償首先要知道雙陰性細胞的情況,其次,必須要用單陽和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下,才能既不會過多又不會過少地調節(jié)補償。


    五、FCM檢測時,每次實驗的細胞數(shù)一定要相同嗎?


    FCM檢測時,若不進行細胞計數(shù)而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少,那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見,不同的細胞量會影響*終的實驗結果。因此,在準備樣本時,必須進行細胞計數(shù),使每個分組及每次實驗的細胞數(shù)保持一致。


原創(chuàng)作者:上海恒遠生物科技有限公司

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