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ELISA實(shí)驗(yàn)如何準(zhǔn)確的稀釋樣本?

點(diǎn)擊次數(shù):49   發(fā)布時(shí)間:2024/10/23 10:06:49

 一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn),必須包含三大要素:性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作,三者缺一不可。在操作過(guò)程中,經(jīng)常遇到樣本稀釋問(wèn)題,需要進(jìn)行樣本稀釋。


一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍的,樣本值高的可能情況     

1、樣本中待測(cè)物含量過(guò)高。一些高豐度蛋白來(lái)說(shuō),比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等,在樣本中本身含量就很高,有的達(dá)到mg/mL濃度。

2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中,大量表達(dá),比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后,大量表達(dá)腫瘤壞死因子α(TNFα),小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后,大量表達(dá)胰島素(INS)。

3、在一些感染性疾病中,大量表達(dá),比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。

4、疫苗原性研究時(shí),注射疫苗的小鼠,會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體。

5、一些被濃縮的樣品,比如重組蛋白的產(chǎn)物,單克隆抗體純品等。

 

二.在ELISA檢測(cè)過(guò)程中,經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題:樣本測(cè)定OD值超過(guò)標(biāo)曲點(diǎn)OD值,造成測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋,如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)? 樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些? 

1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí),容易導(dǎo)致*終結(jié)果偏小。

2、過(guò)度稀釋。過(guò)度稀釋時(shí),容易導(dǎo)致*終結(jié)果偏大。

3、稀釋不夠規(guī)范,引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范,特別是大比例稀釋時(shí),人為偏差大大增加。


三、如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)呢?樣本稀釋的原則如下:在查詢背景知識(shí),或者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),確認(rèn)了樣本濃度過(guò)高,需要進(jìn)行稀釋,就要根據(jù)以下原則,嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。

1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測(cè)定的OD值,要求落在標(biāo)準(zhǔn)品值OD值的半量程內(nèi),假定標(biāo)準(zhǔn)品值的OD值是2.4,那么稀釋后的樣本,OD值接近1.2,在這個(gè)范圍附近,計(jì)算的濃度值*為準(zhǔn)確,以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),得到的樣本濃度*準(zhǔn)確。

2、稀釋過(guò)程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋,是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍,就先稀釋10倍,再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上,再進(jìn)行稀釋20倍,得到200倍。

3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下,樣本取樣量不要低于5uL,越低的取樣量,在混勻取樣過(guò)程中,誤差越大。


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